傳統(tǒng)標準的BCA 蛋白定量分析方法常規(guī)均使用試管或者微孔板進行檢測，通過對傳統(tǒng)方法進行改進，可使用Take3™ 超微量檢測板進行原位微量BCA法蛋白定量分析。待測蛋白樣品和BCA 工作緩沖液按照順序直接加在Take3™板的微量定量孔處、溫浴，使用Epoch™ 微孔板分光光度計進行檢測。和傳統(tǒng)標準BCA 方法(BCA 工作緩沖液和蛋白質樣品體積比為20：1)相比，該方法的蛋白檢測靈敏度有明顯的提高。相比Mini-BCA 分析法，該分析方法更加精確。

　　BCA 法是十分常用的蛋白質比色定量方法，很多試劑供應商都提供基于比色皿和微孔板的BCA 蛋白定量試劑盒。BCA蛋白定量法相對于其它比色定量法具有操作簡單、穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點。相對于蛋白質固有的280nm 吸收峰檢測，BCA 檢測法提高了蛋白檢測靈敏度和特異性，消除了核酸的干擾，核酸干擾在對細胞裂解物或其他生物樣品進行蛋白定量時總是一個難以避免的干擾。在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+ 與BCA 試劑形成紫色絡合物，如圖1. 其吸光值與蛋白濃度成正比。測定在562nm 處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

　　材料和方法

　　BCA 檢測試劑盒及小牛血清 (BSA) 。我們使用兩種實驗方法來進行BCA 檢測。

　　第一種方法是按照NanoDrop 技術手冊推薦的“Mini-BCA”法。其簡要流程是：BCA 檢測系統(tǒng)混合好的10uL BCA 工作緩沖液和10uL 的標準蛋白或待測的10uL 樣品(1：1)在試管中混勻，37℃溫浴30 分鐘后進行檢測。

　　第二種方法是使用Take3超微量多體積檢測板進行原位檢測。其簡要流程是：直接按照順序滴加2uL 標準蛋白或樣品，然后再滴加2uL BCA 工作緩沖液到Take3 板的檢測孔上，標準蛋白和檢測樣品每個2 份，室溫(~22℃)孵育25 分鐘后進行樣品的定量檢測。

　　所有DNA 檢測均使用空白矯正。信噪比(S/N)通過每孔平均熒光信號的標準差扣掉空白值來確定。標準曲線采用線性回歸方程。

　　板布局給出BSA 標準蛋白的位置和濃度以及多達四個未知濃度標準品。這個布局提供了6個標準蛋白濃度點用于制作標準曲線，這6個點位于A-F行，每個點有兩個重復，濃度范圍為0.01-1.0mg/mL，還有4 個檢測孔用于放置未知樣品，位于G、H 行。原位BCA 法和Mini-BCA 法都是用這種布局，來比較試驗的準確性。

　　空白對照是1：1 體積的BCA 工作緩沖液和去離子水。BCA法蛋白定量的檢測波長為562nm。BSA 的實際濃度是使用Take3 和1cm 標準光程的BioCell 石英比色杯在Epoch 分光光度計上檢測得到的。